1、样本准备：

1）石蜡切片：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-95%乙醇 5min-85%乙醇 5min-75%乙醇 5min，蒸馏水洗。

2）冰冻切片：冰冻切片固定10-30min，PBS洗5min，重复3次，滴加 0.3% triton-X100破膜液通透 20min，PBS 洗 5min，重复3次。

3）细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本固定10-30min ，PBS洗5min重复3次，滴加 0.3% triton-X100 破膜液通透 20min，PBS洗5min，重复3次。

2、抗原修复：

组织切片置于盛满 PH 9.0 EDTA 碱性抗原修复液或者 PH6.0 柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于 微波炉内进行抗原修复（也可以用高压 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min 等其他热修复方法）。中火8min，停火 8min ，转中低火 7min ，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定，冰冻切片和细胞样本可省略此步骤。抗原修复液推荐使用我司EDTA9.0抗原修复液（货号：RC04）和柠檬酸抗原修复液（货号：RC03）。

3 、阻断内源性过氧化物酶：切片放入 3%过氧化氢溶液，室温避光孵育 15 min ，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。

4 、非特异性靶点封闭:  切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用抗体稀释液（或者其他封闭液 3%BSA或者山羊血清）均匀覆盖组织，室温封闭 30min 。额外说明：抗体稀释液内含有各种保护剂以及防腐剂，可以用来封闭或者稀释一抗，稀释后的一抗可以长期四度保存（在常温下也可以保存一个月之久）

5 、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37°C1-2h（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

6 、加 HRP 二抗：玻片置于 PBS（PH7.4） 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈内 滴加与一抗相应种属的 hrp 二抗覆盖组织，避光室温孵育 50min ，PBS 洗三次。额外说明：本试剂盒内自带的HRP山羊抗兔二抗为即用型，具有超高灵敏度，随时可用，无需配置。

7 、荧光染料反应：切片滴加即用型荧光反应液均匀覆盖组织室温反应 2-15min，PBS洗三次（预实验可先染3min洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适继续进行后续抗体染色流程）。

8 、抗体洗脱：石蜡切片置于抗原修复液中 95 度水浴 25-40min（根据不同抗体亲和力 灵活调整时间）或者 滴加适量 37 度预热至完全溶解的mIHC 专用抗体洗脱液（冰冻切片爬片 骨组织建议用）覆盖样本，37 度放置 5-20 分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本 37 度放置 5-20 分钟，弃洗脱液，PBS 洗三次，每次 5 分钟（石蜡切片可用热修复洗脱或者抗体洗脱液洗脱，细胞及冰切切片需用抗体洗脱液进行洗脱）

9 、 重复 3-8 步骤（换用另外一种 TYR荧光染料）---第二轮标记

10 、重复 3-8 步骤（换用另外一种 TYR荧光染料）---第三轮标记

11 、重复 3-8 步骤（换用另外一种 TYR荧光染料）---第四轮标记

12 、重复 3-7 步骤（换用另外一种 TYR荧光染料）---第五轮标记

13、DAPI 复染细胞核：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈内滴加 DAPI 即用型染液，避光室温孵育 5min-20min。

14 、封片：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片（推荐使用我司抗荧光淬灭封片剂，货号：RC07/RC06）。

15 、镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。推荐使用我司五标六色多通道荧光显微镜（货号：HL-MIC）搭配Merge批量处理插件（货号：HL-Merge）进行图像采集及处理。

染料激发/发射波长信息参考：

【文章引用试剂盒/方法】 

Co-staining of A and B was performed using a *** color mIHC Fluorescence kit (  Huilanbio  Biological  Technology,  Shanghai,  China)  based  on  the  tyramide  signal  amplification  (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.