三色多重荧光染色试剂盒 Plus（双标三色）是一款为科研人员设计的高效、多重标记工具，专门用于免疫组化实验中的多抗原检测。本文将详细介绍如何使用该试剂盒，帮助你顺利完成从样本准备到结果分析的整个过程，确保实验的高效性和可靠性。

一、试剂盒组成与准备工作

在开始实验之前，首先确认你手中的试剂盒包含以下材料：

• TYR系列荧光染料（例如：TYR-520Plus、TYR-570Plus）
• TSA缓冲液(TSA buffer)
• HRP山羊抗兔/鼠通用二抗  或  HRP山羊抗兔二抗
• DAPI染液（用于细胞核标记）
• 抗体稀释液
• 3%过氧化氢

在使用前，请确保试剂盒中的所有试剂已保存至4°C，并且在有效期内。所有溶液和试剂需在实验开始前准备齐全。

二、样本准备与抗原修复

1. 样本选择：本试剂盒适用于石蜡切片、冰冻切片以及细胞涂片等各种样本。您可以根据自己的实验需求选择合适的样本类型。

   • 1）石蜡切片：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-95%乙醇 5min-85%乙醇 5min-75%乙醇 5min，蒸馏水洗。

     2）冰冻切片：冰冻切片固定10-30min，PBS洗5min，重复3次，滴加 0.3% triton-X100破膜液通透 20min，PBS 洗 5min，重复3次。

     3）细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本固定10-30min ，PBS洗5min重复3次，滴加 0.3% triton-X100 破膜液通透 20min，PBS洗5min，重复3次。

2. 抗原修复：对于石蜡切片，需要进行抗原修复。常用的修复方法是热修复，根据样本类型选择合适的抗原修复方案。

   • 石蜡切片置于盛满 PH 9.0 EDTA 碱性抗原修复液或者 PH6.0 柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于 微波炉内进行抗原修复（也可以用高压 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min 等其他热修复方法）。中火8min，停火 8min ，转中低火 7min ，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定)
   • 冰冻切片和细胞样本可省略此步骤。
   • 抗原修复液推荐使用我司EDTA9.0抗原修复液（货号：RC04）和柠檬酸抗原修复液（货号：RC03）。

3. 阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢溶液中，室温下孵育10-15分钟，以去除内源性过氧化氢酶的活性，防止背景干扰。

4. 封闭非特异性结合位点：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用抗体稀释液（或者其他封闭液 3%BSA或者山羊血清）均匀覆盖组织，室温封闭 30min 。注：慧蓝生物多重免疫荧光试剂盒的抗体稀释液内含有各种保护剂以及防腐剂，可以用来封闭或者稀释一抗，稀释后的一抗可以长期四度保存（在常温下也可以保存一个月之久）。

三、一抗孵育与多重标记

1. 一抗选择与稀释：
   • 选择与目标抗原特异性结合的一抗。根据不同的一抗，稀释液和浓度可能会有所不同，通常一抗稀释液在1:200-1:1000之间。
2. 一抗孵育：
   • 将稀释后的一抗滴加到切片表面，确保完全覆盖样本。
   • 孵育时间一般为1小时（室温下）或4°C过夜。具体孵育时间需根据抗体的特点调整。
3. 二抗孵育：
   • 用HRP山羊抗兔/鼠通用二抗或HRP山羊抗兔二抗进行标记。本试剂盒内自带的HRP山羊抗兔/鼠通用二抗或HRP山羊抗兔二抗为即用型，具有超高灵敏度，随时可用，无需配置。
   • 孵育二抗时，时间可根据实验需求调整，一般为50分钟至1小时。

四、荧光染料反应与标记

1. TSA反应：

   • 将荧光染料与TSA buffer混合后，滴加到切片上，确保完全覆盖，孵育5-10分钟。
   • 每轮标记后，使用PBS清洗切片，去除未反应的染料。

2. 重复标记：

   • 第一轮染色后，要将上一轮的抗体洗脱掉，石蜡切片置于抗原修复液中95度水浴25-40分钟（根据不同抗体亲和力灵活调整时间）。冰冻切片、细胞爬片或骨组织由于容易脱片，抗体洗脱这一步建议滴加适量37度预热至完全溶解的mIHC专用抗体洗脱液均匀覆盖样本，37度放置5-20分钟，弃洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液均匀覆盖样本，37度放置5-20分钟。

   • 然后进行重复的步骤：阻断内源性过氧化物酶—血清封闭—一抗孵育—二抗孵育—TSA荧光染料染色—抗体洗脱。

   • 每轮标记都需要避免交叉反应，确保各抗体的特异性。

五、细胞核染色与封片

1. 细胞核染色：

   • 在最后一个指标显色完成，PBS洗三次后，使用DAPI染液对切片进行细胞核染色。DAPI会与DNA结合，使细胞核呈现蓝色荧光。

2. 洗涤与封片：

   • 用PBS洗涤切片，去除多余的染料。
   • 封片可以用慧蓝生物的防荧光淬灭封片剂进行封片，确保切片的长期保存和高质量观察。

六、显微镜观察与数据分析

1. 荧光显微镜观察和拍照：

   • 利用慧蓝生物多通道荧光显微镜进行镜检，根据荧光染料的发射波长选择不同的通道观察切片，获取多个指标的空间分布信息，根据镜检结果调整染色时间和比例。
   • 拍照可以使用慧蓝生物多通道荧光显微镜配备的相机进行拍照。

2. 扫描仪扫描：HuilanBio扫描仪采用最先进的光学和电子技术，确保每一次扫描都能捕捉到最细微的细节。无论是白光成像还是多色荧光检测，我们的扫描仪都能提供出色的分辨率和灵敏度，使您的研究数据更加精确和可靠。

3. 数据分析：
   • 记录不同标记的荧光强度和位置，分析各个抗原的表达情况。利用慧蓝生物Huilan AI分析软件进行定量分析，获得更加精准的实验数据。

七、注意事项与优化建议

1. 抗体浓度：不同抗体的最佳稀释度可能不同，请参考供应商提供的使用说明书，并根据实际情况进行优化。

2. 反应时间：不同样本和实验条件下，TSA反应的最佳时间可能有所不同。过长或过短的反应时间可能会影响实验结果，请根据实验情况调整。

3. 防止背景干扰：为减少非特异性结合，务必做好封闭工作，避免背景信号过强。

4. 染料选择：根据需要选择不同波长的TYR系列荧光染料，确保每个抗原的标记信号不重叠，避免荧光信号的干扰。