RC780二步法试剂盒是一款为科研人员设计的高效标记工具，专门用于免疫组化实验中的抗原检测。

二步法试剂盒的主要优势有以下两个方面：首先，它的非特异性反应非常少，能够有效减少背景信号的干扰，从而确保结果更加清晰和可靠；其次，RC780二步法不会与690通道产生串色现象，这意味着在多通道实验中，各个通道的数据能够更加独立，避免了信号交叉导致的分析误差。这两个特点使得RC780在实验中表现出色，尤其适用于对信号纯度和准确性要求较高的研究场景。本文将详细介绍如何使用该试剂盒，帮助你顺利完成从样本准备到结果分析的整个过程，确保实验的高效性和可靠性。 

原理介绍:

一抗与组织上的抗原特异性结合后，加入多聚辣根过氧化物酶(HRP)二抗，HRP将带标记的Tyramide活化，后者与相邻的蛋白上的酪氨酸残基生成稳定的共价结合，目的蛋白上会富集大量带有标记的酪胺，加入780二抗显色并使信号进一步放大，此试剂盒中的荧光染料可单独或配合本司多重免疫荧光试剂盒使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能。

试剂盒组成：

注：RC780染色A液用RC780染色B液按1：200比例稀释（若一抗孵育时间常温 1h-3h内，建议稀释比例 1:100- 1:200, 若一抗孵育时间 4 度过夜（12h 或以上），建议稀释比例 1:200- 1:400 或更高），RC780染色C液用抗体稀释液或者PBS按1：100比例稀释。

详细操作步骤

1、样本准备：

1）石蜡切片：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min，蒸馏水洗。

2）冰冻切片：冰冻切片固定10-30min，PBS洗5min，重复3次，滴加0.1-0.5% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重复3次。

3）细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本固定10-30min，PBS洗5min重复3次，滴加0.1-0.5% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重复3次。

2、抗原修复：组织切片置于盛满PH 9.0 EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（也可以用高压1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他热修复方法）。中火8min，停火8min，转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定，冰冻切片和细胞样本可省略此步骤）。

3、阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、BSA封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3% BSA-PBS（或者其他封闭液）均匀覆盖组织，室温封闭30min。

5、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37度2h（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

6、加多聚HRP二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的多聚HRP二抗覆盖组织，避光室温孵1h，PBS洗三次，每次5mim。

7、加RC780染色A液：切片稍甩干后在圈内滴加50-100ul RC780染色A液工作液（用RC780染色液B 200倍稀释，稀释倍数可根据实际情况调整）室温孵育10min，PBS洗三次，每次5min。

8、热修复去降低非特异性：组织切片置于盛满PH 9.0 EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内中火8min，停火8min，转中低火7min（也可以用高压1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他热修复方法），此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（此步骤选做，非必须进行，如果有非特异性染色建议进行此操作）。

9、加RC780染色C液：切片稍甩干后在圈内滴加50-100ul RC780染色C液（用PBS或者抗体稀释液100倍稀释）室温孵育10-30min（染色时间需摸索），PBS洗三次，每次5min。

10、DAPI 复染细胞核：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈内滴加 DAPI 即用型染液，避光室温孵育 5min-20min。

11 、封片：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片（推荐使用我司抗荧光淬灭封片剂，货号：RC07/RC06）。

12、显微镜观察与数据分析

1. 荧光显微镜观察和拍照：

   • 利用慧蓝生物多通道荧光显微镜进行镜检，根据荧光染料的发射波长选择不同的通道观察切片，获取多个指标的空间分布信息，根据镜检结果调整染色时间和比例。
   • 拍照可以使用慧蓝生物多通道荧光显微镜配备的相机进行拍照。

2. 扫描仪扫描：HuilanBio扫描仪采用最先进的光学和电子技术，确保每一次扫描都能捕捉到最细微的细节。无论是白光成像还是多色荧光检测，我们的扫描仪都能提供出色的分辨率和灵敏度，使您的研究数据更加精确和可靠。

3. 数据分析：
   • 记录不同标记的荧光强度和位置，分析各个抗原的表达情况。利用慧蓝生物Huilan AI分析软件进行定量分析，获得更加精准的实验数据。

注意事项：

1. 多聚HRP二抗为即用型，无需稀释直接试用。
2. 进行多轮荧光染色的时候，RC780试剂盒建议在最后一轮染色中使用。
3. RC780试剂盒灵敏度较高，RC780染色A液稀释比例和RC780染色C液染色时间需根据预实验摸索合适的条件。

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