细胞凋亡是生命活动中的关键过程，其异常调控与多种疾病的发生发展密切相关。
慧蓝生物Tunel试剂盒作为经典的细胞凋亡检测工具，以其高灵敏度、特异性和操作简便性，成为科研工作者研究细胞死亡机制的首选方法。
慧蓝生物Tunel试剂盒目前有cy3标记、488标记荧光试剂盒和白光试剂盒。
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产品编号 |
产品名称 |
产品规格 |
目录价格 |
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Tunel 试剂盒 |
RCT-50D |
50T，100T |
￥1500，￥2800 |
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RCT-50G |
50T，100T |
￥1500，￥2800 |
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RCT-50R |
50T，100T |
￥1500，￥2800 |
一、实验原理：
原理（荧光）：细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色FITC或Alexa488/红色荧光探针Cy3(Cyanine 3)标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
原理（白光）：细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。DNA会被降解为180-200 bp的片段，并暴露出大量的3´-OH末端，在TdT酶的作用下，在基因组DNA断裂时暴露出的3´-OH末端掺入生物素标记的dUTP（Biotin-dUTP），随后用辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP,HRP二抗)，检测被生物素（Biotin）标记的DNA末端，最后通过加入HRP的底物混合液（DAB）进行显色反应，使得凋亡细胞的细胞核被染成棕黄色，从而可以用普通光学显微镜检测。
二、实验前准备与确认
石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片或者细胞涂片均可以做Tunel实验。
在开始实验前，首先确认试剂盒包含以下材料：
Tunel试剂盒（cy3）：TdT酶；Tunel反应液（cy3标记）
Tunel试剂盒（488）：TdT酶；Tunel反应液（488标记）
Tunel试剂盒（白光）：TdT酶；Tunel反应液；HRP二抗
在使用前，请确保试剂盒中的所有试剂已保存至-20℃，并且在有效期内。所有溶液和试剂需在实验开始前准备齐全。
三、操作流程
- 荧光试剂盒操作流程：
1、 切片预处理
（1）石蜡切片
a）切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。(冬天应提高脱蜡温度或适当延长脱蜡时间）
b）石蜡通透方式有多种：热修复（EDTA或者柠檬酸修复液 95度水浴25min）、蛋白酶消化（20μg/ml蛋白酶K 37℃处理15-30min）、Triton X-100通透剂通透等。玻片置于蒸馏水中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
（2）冰冻切片
a）固定：冰冻切片固定10-30min，PBS洗5min，重复3次。
b）通透：20μg/ml蛋白酶K 37℃处理15-30min，玻片置于蒸馏水中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
c）（选做）滴加 0.3% triton-X100破膜液通透 20min，蒸馏水 洗 5min，重复3次。
（3）细胞爬片或者细胞涂片
a）固定：冰冻切片固定10-30min，弃固定液，PBS洗5min，重复3次。
b）通透：20μg/ml蛋白酶K 37℃处理15-30min，玻片置于蒸馏水中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
c）（选做）滴加 0.3% triton-X100破膜液通透 20min，蒸馏水洗 5min，重复3次。
2、 配试剂工作液以及孵育：TdT酶 和tunel反应液按1:50比例混合，此液为tunel工作液，将tunel工作液加入到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱避光孵育30min到2小时（具体需要预实验），湿盒内加少量水保持湿度。
3、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
4、 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
5、 镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；488绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）。
- 白光试剂盒操作流程：
1、 步骤1（石蜡切片/冰冻切片/细胞爬片预处理）与荧光试剂盒一致。
2、 双氧水封闭：切片滴加适量3% H2O2室温封闭25min，玻片置于纯水中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、 步骤3与荧光试剂盒步骤2（配试剂工作液以及孵育）一致。
4、 HRP二抗孵育：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，然后hrp二抗工作液室温孵育25min（hrp二抗工作液，Streptavidin-HRP二抗：PBST=1:1000），玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
5、 DAB显色：切片滴加适量新鲜配置的DAB显色液显色数秒，纯水冲洗终止显色（显色较快，注意把控显色程度）。
6、 复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
7、 脱水透明封片：将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min -无水乙醇Ⅰ6min -无水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
四、石蜡切片tunel结果判读
Tunel试剂盒（cy3）：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，试剂盒为cy3标记，阳性凋亡细胞核为红色。
Tunel试剂盒（488）：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，试剂盒为488标记，阳性凋亡细胞核为绿色。
Tunel试剂盒（白光）：Tunel阳性表达细胞核为黄色至棕黄色，正常细胞为蓝色。
五、Tips
1.为了获得理想的染色效果，应对通透方法时间及tunel工作液孵育时间进行摸索
2.所有实验试剂应避免反复冻融，建议分装保存
3.蛋白酶K处理后需充分洗涤去掉多余试剂
4.（白光）Tunel显色为避免假阳性，应严格控制显色过程，可短时间多次显色，镜下观察显色程度，切忌显色过度。
5.（白光）建议设置对照实验，阴性对照（不加TdT酶）、阳性对照（DNase I预处理）验证实验有效性。
六、文章引用试剂盒/方法
TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling) staining was performed with a TUNEL kit(Shanghai Huilanbio Biological Technology, Shanghai, China) which was based on the principel of TUNEL detects the apoptosis according to the instruction manual.
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