原理介绍: 

酪酰胺信号放大(TSA ，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶 蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的 DAB 显色方法  ，TSA 技术同样采用 HRP 标记的二 抗，同样有对应的“显色 ”步骤（HRP 催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底 物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法或者抗体洗脱液洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP 复合物，重复下一种一抗-hrp 二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧 光素底物，如此往复就可实现多重标记。 TSA 详细原理是利用酪胺 Tyramide 的过氧化物酶反应(酪胺盐在 HRP 催化 H202 下形成共价键结合位 点) ，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在 抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到 10- 100 倍增强。简单来说，用这种方法 做多重免疫荧光是利用二抗上带有的 HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧 光素。荧光素在 HRP 和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧 光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧 光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧 光素都结合好后，最后去检测结果。 由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应， 以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用 TSA 技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以 进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中一种或者多 种：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，极大丰富了此试剂盒的内涵。

100T试剂盒组分：

名称	货号	规格	保存条件
TYR-480 Plus  荧光染料	RC006	浓缩型，50ul ，200x	4℃
TYR-520 Plus  荧光染料	RC001	浓缩型，50ul ，200x	4℃
TYR-570Plus  荧光染料	RC002	浓缩型，50ul ，200x	4℃
TYR-620Plus  荧光染料	RC003	浓缩型，50ul ，200x	4℃
TYR-690Plus  荧光染料	RC004	浓缩型，50ul ，200x	4℃
TYR-780Plus  荧光染料	RC005	浓缩型，50ul ，200x	4℃
TSA   buffer	RCB0086	36mL	4℃
HRP 山羊抗兔/鼠通用二抗	RCB054	30mL	4℃
DAPI 染液（即用型）	RC05	10mL	4℃
抗体稀释液	RC01	60mL	4℃
3%过氧化氢	RC012	60mL	4℃

 

试剂盒使用简要流程：（详细操作步骤请参见技术文档——多重免疫荧光实验流程）

 

使用慧蓝生物多重荧光染色Plus试剂盒成像示例：

（A）人输卵管组织指标A（570黄）＋指标B（520绿）＋指标C（690粉）；

（B）小鼠肾组织指标A（570黄）＋指标B（520绿）＋指标C（690粉）;

（C）人胃癌肿瘤指标A（690粉）＋指标B（620红）＋指标C（570黄）＋指标D（520绿）;

（D）人肠组织指标A (570黄)＋指标B (520绿) ＋指标C(690粉) ＋指标D(620红) ＋指标E(480青)。

 

1. 为什么会串色？

答：串色与多种因素有关系：

A、可能与成像设备滤光片带宽有关系，尽量选用窄波长带宽的滤光片；

B、可 能与上一轮抗体未被完全洗脱关系，对于一些亲和力比较高的抗体比如 CK 等，抗体洗脱条件需要延长（提 高洗脱温度 时间等）；

C、可能与信号不平衡有关系，比如相邻两个通道染料，一个强度过高，一个过低，导致强的信号发生外溢；

D、其他可能存在的原因，比如抗体弄混，下一轮抗体忘记洗脱/修复等。

 

2.  TYR-xxxPlus 荧光染料与 TSA buffer 稀释比例怎样优化？

答：本试剂盒灵敏度比较高，是常规 TSA 试剂盒的 10-50 倍，

注意信号不要过强；信号过强 则降低染料浓度/反应时间/一抗浓度，信号过低 则提高染料浓度/反应时间/一抗浓度；

本试剂盒的特点，浓度越高，将成指数倍增强信号；1:50 能获得最强信号，1:500 相当于常规 TSA 信号。

 

3.  抗原修复方式/抗体洗脱方式怎么选择？

答：建议第一轮抗原修复 9.0 EDTA,95 度 15-25min；

第二轮或以上抗体洗脱/抗原修复，建议柠檬酸 6.0,95 度 25min-40min ，针对一些容易掉片的组织，抗体洗脱可以采用抗体洗脱液（我司在售：mIHC 专用抗体洗脱液RC-010）

抗体洗脱液时间过长可能会导致抗原识别降低/DAPI核弱染，注意把控抗体洗脱液时间（一般室温或者37℃5- 15min，1-2次能到到比较理想的结果）。

 

4.  染料是否需要避光？

答：本试剂盒荧光染料抗淬灭性强，全程无需日光灯下避光，使用过程中也无需在暗环境中操作，但不能在太阳光下照射。

 

5.  做多标时，指标/抗体顺序如何选择？

答：难以洗脱的抗体，摆在最后一轮，不然容易串色，比较难做的指标放在前面几轮做（比如 foxp3）， 第一轮通常做适合 EDTA 9.0 修复的指标；慧蓝经验，第一轮通常采用 EDTA 9.0水浴法/柠檬酸6.0高压法，第二轮及其以上通常采用柠檬酸6.0高压法 ，多抗建议均采用柠檬酸6.0高压法。

 

6.  为什么有时候有非特异性或者非特异是怎么产生的以及怎样改善？

答：非特异的产生有几种可能，

A：抗体是多克隆的，容易产生非特异，可以换用单克隆抗体或者降低浓 度以及修复强度来改善；

B：信号放大过强，可以降低染液反应时间或者浓度；

C：一抗浓度过高或者修复过度，采用比较低的稀释抗体比例，或降低修复强度（温度或者时间或者修复液 PH）。

 

7.  做石蜡切片 mIHC,抗体应该怎样选择？

答：尽量选用单克隆抗体，抗体应用选用 IHC /mIHC/ IHC-P,优先选用经过敲除验证的抗体等。

 

8.  本试剂盒对于其他进口/国产试剂盒优势在哪里？

答：A、超高的性价比，其他品牌试剂盒动辄过万，我司试剂盒价格在 2k- 1w 之间；

B、稳定性好：即使 试剂盒不小心被放在常温，也能在一个月的放置后，可以继续使用 以及检测信号灵敏度无差异，慧蓝生物开发的此款试剂盒，采用了最新配方，有各种保护剂、防腐剂 H2O2 稳定剂等成分，极大提高了试剂盒稳定性；

C、超高灵敏度：最高灵敏度可以达到市场其他公司的 10-50 倍。

【近年用慧蓝试剂盒发表的文章】
[1] Wang X, Liao J, Shi H, Zhao Y, Ke W, Wu H, Liu G, Li X, He C. Granulosa Cell-Layer Stiffening Prevents Escape of Mural Granulosa Cells from the Post-Ovulatory Follicle. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 1:e2403640. doi: 10.1002/advs.202403640. Epub ahead of print. PMID: 38946588.
[2] Liu ZQ, Dai H, Yao L, Chen WF, Wang Y, Ma LY, Li XQ, Lin SL, He MJ, Gao PT, Liu XY, Xu JX, Xu XY, Wang KH, Wang L, Chen L, Zhou PH, Li QL. A single-cell transcriptional landscape of immune cells shows disease-specific changes of T cell and macrophage populations in human achalasia. Nat Commun. 2023 Aug 4;14(1):4685. doi: 10.1038/s41467-023-39750-5. PMID: 37542039; PMCID: PMC10403544.
[3] Wang N, Jiang Y, Li M, Wang H, Pan J, Tang Y, Xie S, Xu Y, Li X, Zhou X, Xu P, Lin W, Wang X. Protein Kinase STK24 Promotes Tumor Immune Evasion via the AKT-PD-L1 Axis. Adv Sci (Weinh). 2024 Mar;11(12):e2304342. doi: 10.1002/advs.202304342. Epub 2024 Jan 16. PMID: 38229183; PMCID: PMC10966517.